[생명과학] 단백질 분석: 크로마토그래피, 등전점 전기영동, SDS-PAGE

 

 

효소를 연구하는 생화학적 접근 방법은 단백질들을 정제하고 이들의 특성을 분석한다. 이를 통해 생체 주요 구성 물질인 단백질에 대한 정보를 얻을 수 있고 더 나아가 다양한 생명 현상에 대한 이해를 높일 수 있다.

 

크로마토그래피

크로마토그래피는 샘플을 이동상에 녹인 뒤 고정상 위로 흘렸을 때 고정상과 상호 작용하는 정도의 차이로 인해 각 성분 물질들이 분리되도록 하는 실험 방법이다.

 

1. 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC)

(1) 적은 양의 샘플을 고정상 위의 한쪽 끝에 점으로 찍어준다.

(2) 용기 속의 이동상에 고정상을 살짝 담가준다.

(3) 모세관 현상에 의해 이동상이 고정상을 따라 올라간다. 이때 샘플의 성분들이 이동상과의 상호 작용 차이에 따라 분리되면서 이동한다.

 

여기서 물질들의 이동은 고정상과 이동상이 상호 작용하는 정도에 따라 달라진다. 그렇기 때문에 물질들이 고정상에서 상대적 위치에 따라 분리된다.

 

2. 겔 여과 크로마토그래피(Gel filtration chrromatography)

(1) 이동상과 섞여있는 샘플을 다공성 충전제들이 들어있는 컬럼에 붓는다.

(2) 샘플의 크기에 따라 컬럼에서 내려오는 속도가 달라져 용출의 차이가 나타난다.

(3) 먼저 용출되는 순서대로 물질을 분리한다.

 

겔 여과 크로마토그래피에서 사용되는 고정상은 특정한 크기의 구멍들이 뚫려있는 다공성 충전제다. 이 고정상에서 나타나는 특징은 분자의 크기에 따라 물질이 용출되는 속도가 다르다는 점이다. 

샘플이 큰 분자일 경우에는 충전제의 구멍 속으로 들어갈 수 없기 때문에 충전제들 사이의 큰 틈으로 빠르게 흘러내린다. 반면에 샘플이 작은 분자일 경우에는 충전제의 구멍 속으로 들어가면서 이동 경로가 더 길어지기 때문에 관을 천천히 통과한다.

즉, 크기가 큰 분자에서 작은 분자 순으로 물질이 분리되는 것이다.

컬럼의 관 길이가 길수록 더 오랫동안 컬럼 내에서 머물게 되어 물질 분리가 세세하게 이루어진다. 하지만 그만큼 물질들의 체류 시간이 길어지기 때문에 과정 중 주변으로 확산되어 퍼져버릴 수도 있다. 따라서 적당히 물질 분리가 잘 일어날 수 있는 길이의 컬럼을 사용해야 한다.

 

3. 이온 교환 크로마토그래피(Ion-exchange chromatography)

(1) 이동상과 섞여있는 샘플을 특정 전하의 물질로 코팅된 충전제들이 들어있는 컬럼에 붓는다.

(2) 샘플의 전하에 따라 특정 물질들이 먼저 용출된다.

(3) 충전제와 정전기적으로 붙어있는 나머지 물질들을 용출시키기 위해 NaCl이나 pH 구배가 있는 용출액을 흘려준다.

(4) 나머지 물질들이 차례로 용출된다.

 

이온 교환 크로마토그래피에서 사용되는 고정상은 특정 전하의 물질로 코팅된 충전제며 충전제의 전하가 무엇이냐에 따라 두 가지로 나눌 수 있다.

 

1) 양이온 교환 크로마토그래피

양이온 교환 크로마토그래피는 음전하를 띠는 충전제로 채워져있다. 음전하의 충전제와 같은 음전하를 띠는 물질들이 먼저 용출되며 양전하의 물질들은 충전제에 붙어있다가 염 처리 시 결합력이 약한 순서대로 흘러나온다.

 

2) 음이온 교환 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피는 양전하를 띠는 충전제로 채워져있다. 양전하의 충전제와 같은 양전하를 띠는 물질들이 먼저 용출되고 음전하의 물질들은 마찬가지로 충전제에 붙어있다가 염 처리 시 결합력이 약한 순서대로 흘러나온다.

 

4. 친화 크로마토그래피(Affinity chromatography)

(1) 이동상과 섞여있는 샘플을 특정 화학기의 물질로 코팅된 충전제들이 들어있는 컬럼에 붓는다.

(2) 샘플과 충전제의 친화력에 따라 특정 물질들이 먼저 용출된다.

(3) 충전제와 정전기적으로 붙어있는 나머지 물질들을 용출시키기 위해 NaCl이나 pH 구배가 있는 용출액을 흘려준다.

(4) 나머지 물질들이 차례로 용출된다.

 

친화 크로마토그래피에서 사용되는 고정상은 특정 화학기의 물질로 코팅된 충전제다. 충전제와 친화력이 있는 샘플의 분자들이 충전제에 달라붙어 흘러나오지 않으며 친화력이 없는 분자들이 우선적으로 용출된다. 이후에 염을 처리하면 결합력이 약한 순서대로 흘러나온다.

 

 

등전점 전기영동(Isoelectric focusing, IEF)

등전점 전기영동은 섞여 있는 물질들을 겔에서 pI 값에 따라 분리하는 실험 방법이다.

 

1. '30% 아크릴 아마이드 + 비스아크릴아마이드 용액', '양쪽성 전해질 용액', '50% 글리세롤', '10% APS', 'TEMED'를 섞어 폴리아크릴아마이드 겔을 만든다.

 

2. 분리하고자 하는 단백질들이 섞인 샘플을 겔의 홈에 올려놓는다.

 

3. 겔의 양 끝에 전극을 걸어 단백질들이 등전점에 따라 이동하도록 한다.

 

물질들은 각자가 갖고 있는 고유한 pI값에서 이동을 멈추게 되는데 이러한 원리를 통해 물질이 분리된다.

 

 

SDS-PAGE

SDS-PAGE는 샘플 속 단백질들을 분자량에 따라 밴드 형태로 분리하는 실험 방법이다. 여기서 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 계면 활성제로 2개의 아미노산마다 한 분자씩 붙어서 아미노산 R기의 전하를 모두 상쇄시키는 역할을 한다. 이 과정을 통해 단백질들은 선형의 폴리펩티드로 변성되고 길이에 비례해 음전하를 띠게 된다.

 

1. 분리용 겔 용액을 유리판 사이에 부어서 굳힌다.

 

2. 스태킹 겔 용액을 유리판 사이에 붓고 콤을 설치한 뒤 굳힌다.

 

3. SDS 겔 로딩 완충 용액이 들어있는 시료를 가열해 단백질들을 변형시킨다.

 

4. 스태킹 겔이 굳으면 콤을 제거하고 전기영동 장치에 장착한다. 그리고 완충 용액을 붓는다.

 

5. 겔의 홈에 시료들을 넣고 전기영동을 수행한다.

 

각 폴리펩티드들은 (-)에서 (+) 방향으로 이동해 아크릴아마이드의 그물구조 속을 빠져나가면서 분리된다.

길이가 짧은 단백질들이 먼저 빠져나오며 길이가 긴 단백질들은 상대적으로 천천히 전개된다.

여기서 나타나는 단백질의 수는 종류와 같고, 단백질의 길이는 분자량과 같다.